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  • 一株鹅巴氏杆菌的分离及鉴定

    养鹅网  2020-02-11

    鹅巴氏杆菌病,是由多杀性巴氏杆菌引起鹅的一种急性、接触性、败血性传染病。本病对各种家禽都有易感性。临床上分为急性型和慢性型两种,急性型表现为败血症,发病率和死亡率都很高;慢性型表现为肉髯水肿、关节炎,病死率比较低。剖检特征性病变是全身黏膜、浆膜点状出血,出血性肠炎及肝脏的灰白色坏死点。该病呈世界性分布,呈散发性或流行性,给养禽业造成巨大的经济损失,是一种值得重视的疾病,被列为重点防治的家禽细菌性疾病之一。目前,禽霍乱的发生有上升的趋势,加之该病的病程短促,发病率和死亡率都较高,给养禽业造成巨大的经济损失。因此,加强对多杀性巴氏杆菌的研究,对控制禽霍乱的发生,保护和促进养鸭的健康发展具有重要意义。

    2014年2月,重庆某养殖场1000羽肉鹅发生了疑似巴氏杆菌感染的急性传染病,根据其形态特征、培养特性、生化鉴定、16SrDNA基因序列分析和小白鼠攻毒试验等进行鉴定,确定是巴氏杆菌引起的急性传染病。根据药敏试验结果进行有效的治疗,病情已得到控制。

    1材料与方法
    1.1材料
    1.1.1病料:重庆某养殖场送的发病鹅5羽。

    1.1.2试剂与仪器:PCR仪(Eppendorf,德国),电泳仪、凝胶成像仪(Biorad,意大利);DNA片断回收试剂盒购自TaKaRa公司(大连);Taq酶、Buffer、DNA聚合酶、2000DNAmarker、琼脂糖、dNTPs均购自上海生工生物工程有限公司;营养琼脂、麦康凯培养基、微量生化发酵管、药敏片均购自杭州微生物试剂有限公司。

    1.1.316SrDNA通用引物:上游引物P1:5LAGAGTTTGATCCTGGCTCAG一3’;下游引物P2:5’一ACGGCTACCTTGTTACGACT-3’。

    1.2方法
    1.2.I流行病学调查:通过询问了解鹅场发病情况,包括鹅群来源、饲养管理及免疫情况、发病主要症状、病死率及用药等。

    1.2.2病理剖检:按常规方法对送检病死肉鹅进行剖检,观察主要脏器的病理变化,并无菌采取病料进行细菌分离鉴定。

    1.2.3细菌分离:无菌采取心脏、肝、脾等病变组织接种于兔鲜血平板,37℃培养24h,挑菌,革兰氏染色、镜检,通过平板划线法进行细菌分离纯化。

    1.2.4生化试验:根据微量生化发酵管说明书,取纯化菌株纯培养物分别接种葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖、山梨醇、卫矛醇、肌醇、鼠李糖、甘露醇、尿素酶、VP、MR、硫化氢、触酶和氧化酶等生化试管。

    1.2.516SrDNA基因序列分析:将分离菌采用煮沸裂解法制备细菌基因组DNA模版,进行PCR扩增。PCR反应条件:94℃预变性7min,94℃变性60S,55℃退火60S,72℃延伸90S,循环次数30个循环,最后72℃延伸10min,4℃保存。反应结束后取10gLPCR产物,用1.2%琼脂糖凝胶电泳观察。PCR产物的回收纯化,送上海生物工程有限公司进行DNA序列的测定。将所测得的序列与Genbank中的16SrDNA序列进行分析比较。

    1.2.6毒力试验:用分离纯化的细菌培养物注射小白鼠,48h内观察小白鼠的情况。

    1.2.7药敏试验:将分离的细菌均匀涂布于含兔血琼脂平板表面,将各种抗生素纸片均匀贴在平板表面,每个平板6张,37℃培养24h,测抑菌圈的直径大小。

    2结果
    2.1流行病学调查与剖检病变
    发病鹅群为养殖户的肉鹅,发病前1个星期温度变化大,第4d开始出现死亡病例,饲养员当时没引起注意,到了第7d后,平均每天约有10羽鹅发病死亡,曾使用庆大霉素、卡那霉素等药物治疗效果均不明显。发病鹅个别出现厌动、食欲下降、流涎、鼻腔有黏性分泌物,拉绿色或白色稀粪,其他症状不明显。剖检可见肺脏瘀血、出血,气管环状充血;心包大量黄色渗出液或胶冻样渗出物,心肌与心冠脂肪大量点状出血;肝脏质脆,表面有白色或淡黄色针尖大小坏死点;十二指肠充血、出血,肠壁变薄。

    2.2实验室诊断
    对采集的病鹅的心脏、肝、脾等病变组织进行病原分离,结果分离到1株革兰氏阴性小杆菌,该菌在麦康凯琼脂平板上不能生长,可在营养琼脂平板上生长,在兔血平板37℃培养24h可见中等大小的淡灰白色、湿润、露珠样菌落,无溶血性,革兰氏染色、镜检可见两端钝圆的杆菌。

    2.3生化试验结果
    显示葡萄糖、蔗糖、果糖、触酶试验和氧化酶试验阳性,而麦芽糖、乳糖、山梨醇、卫矛醇、肌醇、鼠李糖、甘露醇、尿素酶、VP、MR反应阴性,产生硫化氢。与多杀性巴氏杆菌生理生化特征相符合。结果见表1。



    2.416SrDNA基因序列分析
    以P1和P2为引物,将分离菌采用煮沸裂解法制备细菌基因组DNA模版,优化缓冲体系和镁离子浓度,可以扩增出约1500bp的特异条带。从琼脂糖凝胶上切割特异性条带,试剂盒回收纯化PCR产物,送上海生物工程有限公司进行DNA序列的测定。将所测得的序列与Genbank中的16SrDNA序列进行相似性分析比较,与多杀性巴氏杆菌(菌株的登录号为:CP003022)的16SDNA序列的同源性达到了99%。综合生理生化鉴定和16SrDNA测序的结果,可以认为该菌为多杀性巴氏杆菌。

    2.5毒力实验
    用分离纯化的细菌培养物浓度2.5×108CFU/g,注射小白鼠,8h内10只小白鼠全部死亡。

    2.6药物敏感性试验结果
    对分离得到的多杀性巴氏杆菌进行药敏试验,结果表明该菌对头孢曲松钠、头孢氨噻肟高度敏感;对诺氟沙星、利福平、先锋必素、新霉素、磺胺异恶唑和先锋霉素V低度敏感;而对美满霉素、氟苯尼考、淋必治、强力霉素、痢特灵、阿莫西林、奥复星、复方新诺明、洁霉素和万古霉素不敏感。结果参照表2。


    3讨论与结论
    近年来,禽霍乱的发生有上升的趋势,加之该病病程短促,发病率和死亡率都较高,给养禽业造成巨大的经济损失。应加强对该病的免疫预防,避免该病的发生和流行,以保护和促进养禽业的健康发展。对发病的鹅场采用头孢曲松钠和头孢氨噻肟药物治疗,同时采用巴氏杆菌自家苗,使疫情得到了有效的控制。本研究从发病鹅肝脏、心脏、脾脏中分离并纯化的细菌,经形态特征、培养特性、生化鉴定及PCR鉴定结果,确定从发病鹅中分离的细菌为多杀性巴氏杆菌。根据药敏试验结果显示,该菌对多种抗生素具有耐药性,这可能与养殖场抗生素滥用有关。

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